– 18 anställda vid den ryska ambassaden måste lämna landet inom 48 timmar, säger tillförordnade utrikesminister Jan Hamacek vid en pressträff på lördagen.
Hamacek och premiärminister Andrej Babis uppger att de 18 diplomaterna har identifierats som säkerhetsagenter kopplade till de ryska underrättelsetjänsterna GRU och SVR.
– Det finns välgrundade misstankar om att officerare i ryska underrättelsetjänsten GRU, enhet 29155, var inblandade i explosionen i ammunitionsdepon i Vrbetice, säger Babis.
Två personer dödades när flera explosioner inträffade i ammunitionslagret i oktober 2014. De dödade var anställda vid ett privat företag som hyrde lagret från en statlig militär organisation.
Vladimir Dzjabarov, ställföreträdande ordförande i ryska federationsrådets utrikesutskott, säger enligt Interfax att anklagelsen är absurd.
Tjeckisk polis meddelade samtidigt under lördagen att den eftersöker två män för inblandning i explosionerna. Männen bär på flera pass, däribland ryska pass under namnen Aleksandr och Ruslan Bosjirov.
Namnen användes som alias av två ryska underrättelseofficerare som pekats ut för att ha försökt giftmörda den tidigare ryske agenten Sergej Skripal i Storbritannien 2018.